突變質(zhì)粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的構(gòu)建及表達(dá)

摘要： [目的]構(gòu)建CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)真核表達(dá)質(zhì)粒并觀察其蛋白表達(dá)。[方法]將NotⅠ的酶切位點(diǎn)(GCGGCCGCC)引入第一次PCR的后引物,擴(kuò)增并突變hPROKR2的1-1035bp(343YFK/AAA345),再將NotⅠ的酶切位點(diǎn)和3個(gè)連續(xù)甘氨酸突變堿基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物擴(kuò)增并突變hPROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353),通過(guò)NotⅠ酶切位點(diǎn)連接前后兩個(gè)片段,即可構(gòu)建pcDNA3.1-hPROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),最后通過(guò)測(cè)序鑒定突變是否成功。擴(kuò)增hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),連接入CMV-3flag。WesternBlot檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。[結(jié)果]成功構(gòu)建CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)質(zhì)粒,并驗(yàn)證到相應(yīng)蛋白表達(dá)。[結(jié)論]利用NotⅠ酶的堿基序列特性(GCGGCCGCC)進(jìn)行3個(gè)連續(xù)氨基酸突變的方法簡(jiǎn)單有效。質(zhì)粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的成功構(gòu)建為后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造條件。 ... （共7頁(yè)）