在新開發(fā)或改進生物催化劑時,通常要進行微生物采集,測定酶突變體表達文庫或者宏基因組文庫的酶活性,高通量活性篩選是關鍵步驟之一。理想情況下,篩選是在操作條件下的可靠反應,反應進程用分析儀器如高效液相色譜儀、氣相色...[繼續(xù)閱讀]

    醇脫氫酶將NAD(P)+轉化為NAD(P),在340nm處使用紫外或熒光能檢測到這一反應。然而,信號往往會被污染物或其他檢測組分所掩蓋,如檢測是在全細胞中或存在其他發(fā)色團時,還原型輔因子非常不穩(wěn)定。信號穩(wěn)定在間接檢測中也是一個問題...[繼續(xù)閱讀]

    20世紀90年代,醛縮酶催化抗體的發(fā)現(xiàn)使得人們在篩選非天然醛縮酶型底物生物轉化醛醇縮合反應方面的興趣日增[6～8]。上面提到的醇脫氫酶(ADH)檢測可以在丁間醛醇底物形式上修飾,例如底物6通過逆丁間醛醇/順序β-消除反應來檢測逆...[繼續(xù)閱讀]

    圖式1-3轉醛醇酶和轉酮醇酶的熒光底物coum:圖中化合物10的縮寫轉醛醇酶10～12(圖式1-3)的相關體系后來被開發(fā)[12]。各種轉醛醇酶的戊酮型/己酮型立體異構性可以通過熒光立體異構底物對11/12檢測。然而與天然底物相比,這些底物的轉...[繼續(xù)閱讀]

    醛縮酶類生物催化劑通常希望用來催化酮供體的烯醇化。然而通過熒光直接檢測烯醇化作用是不可能的。最近發(fā)現(xiàn),二羥基丙酮香豆醚14可以作為在水緩沖溶液中的一種熒光烯醇化探針(圖式1-4)[16]。通過傘形酮的β-消除反應形成烯醇...[繼續(xù)閱讀]

    傘形酮酯或硝基苯酚酯作為脂肪酶底物的缺點在于它們的低水溶性和高的非特異性。因為脂肪酶是界面酶,因此一直在進行檢測設計的探索:這些底物在酶溶液中是穩(wěn)定的,且在高表面積的材料上不溶。實現(xiàn)這個設計最好是使用浸漬硅...[繼續(xù)閱讀]

    夾子-O底物是水解酶熒光和顯色底物的最可靠種類之一,特別是脂肪酶(例如19)[30～32]。這些底物依據于雙間接釋放機制,1,2-伯二醇產物與高碘酸鈉形成的不穩(wěn)定的醛或酮連續(xù)開環(huán),產生熒光信號(例如21),經過β-消除反應釋放傘形酮5或硝...[繼續(xù)閱讀]

    在脂肪酶和酯酶底物的酯功能上,通常使用脂肪族醇而不是酸性苯酚類化合物,這是獲取這些酶選擇性探針的關鍵。在這種情況下,利用伯醇產物的氧化分解即可得到解決。熒光氰醇和羥基酮能自發(fā)反應生成熒光苯酚,接著是連續(xù)β-消除...[繼續(xù)閱讀]

    傘形酮能與多種脂肪酸氯甲基酯烷基化反應,產生乙酰氧甲基醚,且得率不錯(例27)[38]。這些底物在緩沖液中經過脂肪酶/酯酶-催化水解反應形成傘形酮(圖式1-9)[39]。其機制可能涉及一個不穩(wěn)定的半縮醛中間體,它能自發(fā)反應生成甲醛和...[繼續(xù)閱讀]

    FRET(熒光或Förster共振能量轉移)是最基本的原則之一,用來設計裂解反應的熒光底物和眾所周知的蛋白酶和脂肪酶底物。盡管雙重標記強烈影響反應活性,但應用脂肪酶FRET底物仍然得到了研究。圍繞1,2-二醇單酯功能的各種變量調查...[繼續(xù)閱讀]